摘要
本文开发的43色方案用于表征人外周免疫系统中的大多数免疫亚群，包括常规T细胞，非常规T细胞如不变的自然杀伤性T细胞（iNKT），γδT细胞亚群（TCRVδ2，TCRVγ9）和粘膜相关的不变T细胞（MAIT），B细胞亚群，自然杀伤（NK）细胞，浆细胞样树突状细胞，树突状细胞亚群，造血祖细胞，嗜碱性粒细胞和先天性淋巴样细胞（ILC）亚群（CD,CRTH2）。该方案还包括用于分析激活（CD38，HLA‐DR，ICOS/CD），分化（CD45RA，CD27，CD28，CD57），细胞因子和趋化因子受体（CD25，CD，CCR10，CCR6，CCR4，CXCR3，CXCR5，CRTH2/CD）以及共抑制和耗竭分子（PD-1，CD/LAG-3，TIGIT），可对外周血中的PBMC进行深入表征，涵盖了人类外周血中多种不同的细胞群。在5激光CytekAurora上分析细胞，并使用FlowJo进行数据分析。该方案可以帮助您对免疫系统进行全面的解释，特别是在标本数量少的情况下。
比较1，质谱流式（CyTOF）：a)理论同时检测上限约种同位素，已发表文献最多47种。b)40色以上文献最多（同位素信号溢出与荧光染料溢出相比为最低水平）。c)对多重样品进行条形码编码。d)染色后可冷冻保存样品。e)低的样品采集速率（每秒约个细胞），传统流式更高速（每秒高达,个事件）。2，光谱流式a)已发表最多40色（OMIP）和本文43色方案。b)高的样品采集速率（每秒约40,个细胞），使微小含量的细胞分析成为可能。c)有超过种可用于流式细胞术的荧光染料，它们大多数共享相同的激发和发射最大值，这限制了在单个方案中组合使用它们的能力。d)测量完整的发射光谱，然后将光谱解混以鉴定单个的荧光染料。这样可以在单个方案中使用具有相似激发和发射最大值的荧光染料，从而增加了可以同时分析的标记物的数量。可同时使用的组合如BV/PacificBlue,BV/SYTOXBlue,eFluor/BV,BrilliantBlue/FITC,PerCP/BrilliantBlue/PerCP‐eFluor,CF/PE/CF,PE/Dazzle/CF/PE‐AlexaFluor,和APC/AlexaFluor等，这是传统流式细胞术无法实现的。材料和方法
1，样本：冻存的健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）。
2，使用Veri-CellsPBMC（Biolegend,SanDiego,CA）进行抗体滴定，以确定提供最高染色指数的抗体浓度。
3，染色缓冲液（FBS）（BDBiosciences,SanJose,CA）用于洗涤和重悬细胞。
4，AbCTotalAntibodyCompensationBeadKit(Invitrogen,Waltham,MA)单标抗体创建荧光染料参照光谱库。
5，SYTOXBlueDeadStain的参照光谱使用的PBMC染色。
6，CF和CF的Mix-n-tainCF染料抗体标记试剂盒购自Biotium(CA)，并按照试剂盒制造商的说明分别与CRTH2和CD1c抗体偶联。
7，为了减少溢出现象并提高多色样品染色中标记物的分辨率，大多数抗体需要使用低于基于单染得到的滴度的浓度。
表1.方案中使用的抗体清单。
染色和数据采集
1，每次染色使用了1×PBMC。
2，按照标准方案解冻PBMC。
3，与HumanTruStainFcXFc受体封闭溶液（Biolegend）和True-Stain单核细胞封闭剂（Biolegend）孵育10分钟。
4，准备好抗体预混液。
5，在LaminarWash96孔板（CurioxBiosystemsCo.,Ltd,Seoul,SouthKorea）的孔中与PBMC混合。
6，每个孔中的最终体积为30μl，并在室温避光孵育40分钟。
7，用Curiox层流洗涤系统HT通过层流洗涤细胞九个循环
8，将细胞重悬于含有SYTOXBlueDeadCellStain的染色缓冲液（FBS）中。
9，转移至常规96孔U底板中。
10，在CytekAurora流式细胞仪（5激光:nm，nm，nm，nm和nm）上，使用SpectroFlov2.2.0.2软件采集数据。
11，使用自发荧光提取选项和存储的参照光谱库进行解混。
12，解混的FCS文件用于进一步的数据分析。
图1.手动门控策略用于从PBMC中鉴定个免疫亚群。
在进行门控之前，将七个重复样本的数据中活的、单个细胞合并成一个FCS文件。Bregs，调节性B细胞；CM，中央记忆；DC，树突状细胞；DP，双阳；EM，效应记忆；EMRA，效应记忆重新表达RA；ILC，先天淋巴样细胞；Neg，阴性；Pos，阳性；Treg，调节性T细胞；pDC，浆细胞样树突状细胞；SP，单阳
对七个重复样品（均取自同一瓶PMBC）进行了染色。使用默认设置对所有样本运行flowAI[3]，以检查流速，信号采集和动态范围的变化，并将算法标记为高质量的事件用于进一步分析。所有FCS文件都在单个活细胞上进行门控，并合并成一个FCS文件，该文件用于手动门控，降维（UMAP和opt-SNE）和聚类（FlowSOM）分析。为了进行聚类和降维分析，选择了所有42个表面标记。UMAP[4]使用默认设置运行，而opt‐SNE[5]的Perplexity增加到50以实现最佳群集。FlowSOM[6]以SOM网格大小30×30和元群集数目45运行。
结论本方案讨论了周围免疫系统中的大多数免疫亚群，这将有助于全面了解免疫系统，尤其是从患者那里获得的少量标本。局限性包括缺乏对细胞亚群和验证的基准测试。旨在证明该方案为使用基于荧光染料的方法进行超高维流式细胞术提供了可能性。该方案可以作为指南，帮助您理解可以在光谱流式细胞术中工作的荧光染料标记组合，并为开发优化其他多色免疫表型方案提供指导。40色方案文案点击阅读：
荧光流式多色方案的新突破
Reference
Developmentofa43colorpanelforthecharacterizationofconventionalandunconventionalT‐cellsubsets,Bcells,NKcells,monocytes,dendriticcells,andinnatelymphoidcellsusingspectralflowcytometry
FairoozSahirJerichaMilesMateoMartinSteinhoffKodappullySivaramanSiveen
Firstpublished:18December
